Layton Kyouju to Eien no Utahime

Profesor Layton dan asistennya, Luke, menerima permintaan dari penyanyi opera Jenis Quatlane untuk menghadiri pertunjukan barunya dan membantu menyelesaikan sebuah misteri. Temannya, Melina, yang dikira telah meninggal setahun sebelumnya, tiba-tiba muncul kembali sebagai seorang gadis berusia tujuh tahun yang mengaku mengetahui rahasia keabadian dan memiliki informasi yang hanya diketahui oleh Melina asli. Tertarik, Layton dan Luke pergi ke gedung opera Crown Petone sementara Remi tetap tinggal di London untuk menyelidiki kasus anak perempuan yang hilang. Pertunjukan opera tersebut menceritakan kisah seorang ratu di Kerajaan Abadi yang sakit dan meninggal, setelah itu sebuah ramuan keabadian diciptakan. Rakyat kerajaan, yang ingin kembali bersatu dengan ratu mereka, meminum ramuan itu untuk menjadi abadi. Cerita diakhiri dengan seorang pria berwajah tertutup yang menantang penonton untuk bermain sebuah permainan, menawarkan keabadian bagi pemenangnya dan kematian bagi yang lainnya. Layton dan Luke harus ikut serta dalam permainan tersebut untuk mengungkap kebenaran di balik keabadian. Peristiwa ini berlangsung antara permainan *Professor Layton and the Last Specter* dan *Professor Layton and the Miracle Mask*.