Layton Kyouju to Eien no Utahime

لیتون و شاگردش درخواست خواننده اپرا، جنیس کواتلین، را برای حضور در اجرای او و کمک به حل یک معما می‌پذیرند. دوست او، ملینا، یک سال پیش درگذشته بود اما به شکل یک دختر هفت‌ساله ظاهر شد که ادعا می‌کرد راز زندگی جاودان را کشف کرده و دانشی دارد که تنها ملینای واقعی از آن آگاه است. کنجکاو، لیتون و لوک به اپرای کراون پتون سفر می‌کنند در حالی که رمی در لندن برای بررسی دختران گمشده تحقیق می‌کند. اپرا داستان ملکه‌ای در پادشاهی Immortals را روایت می‌کند که بیمار شد و مرد، پس از آن معجونی برای جاودانگی ساخته شد. مردم پادشاهی که آرزوی دیدار مجدد با ملکه خود را داشتند، معجون را نوشیدند تا جاودانه شوند. داستان با مردی ماسک‌دار به پایان می‌رسد که از تماشاگران دعوت به بازی می‌کند و به برنده زندگی جاودان و به دیگران مرگ را وعده می‌دهد. لیتون و لوک باید برای کشف حقیقت پشت زندگی جاودان در این بازی شرکت کنند. این رویدادها بین بازی‌های Professor Layton and the Last Specter و Professor Layton and the Miracle Mask رخ می‌دهند.