Layton Kyouju to Eien no Utahime

レイ顿教授とその弟子ルーカスは、オペラ歌手のジェニス・クアターランから、彼女の公演に出席し謎を解決するよう依頼を受ける。ジェニスの友人メリナは1年前に死亡していたが、7歳の女の子として再び姿を現し、永遠の命の秘密を発見したと主張し、本物のメリナしか知らない知識を持っているという。この出来事に興味を惹かれたレイトンとルーカスは、クラウン・ペトネのオペラハウスへ向かう一方、レミはロンドンに残り、行方不明になった少女たちの調査を行う。上演されたオペラは、不老の国に住む王女が病に倒れ亡くなり、その後永遠の命をもたらす薬が作られたという物語である。国の人々は王女と再会しようと願い、その薬を飲み不老不死となった。物語の最後には、マスクをかぶった男が観客にゲームに挑戦するよう呼びかけ、勝者には永遠の命を、敗者には死をもたらすという。レイトンとルーカスはこのゲームに参加し、永遠の命の真実を解明しなければならない。この出来事は、ゲーム『Professor Layton and the Last Specter』と『Professor Layton and the Miracle Mask』の間に起こる。