Layton Kyouju to Eien no Utahime

Layton ve asistanı Luke, opera sanatçısı Jenis Quatlane'dan bir performansa katılmaları ve bir gizemi çözmeleri yönünde bir istek alırlar. Jenis'in bir yıl önce hayatını kaybetmiş olan arkadaşı Melina, yedi yaşındaki bir kız olarak yeniden ortaya çıkmış ve sonsuz yaşamın sırrını keşfettiğini, sadece gerçek Melina'nın bildiği bilgilere sahip olduğunu söylemiştir. İlgi duyan Layton ve Luke, Crown Petone opera binasına gitmeye karar verirken, Remi Londra'da kayıp kızları araştırmaya devam eder. Opera, Ölümsüz Krallığı'nda bir kraliçenin hastalanıp ölmüş, ardından ölümsüzlük için bir iksir yaratılmıştır. Krallığın halkı, kraliçeleriyle birleşmek istemiş ve iksiri içerek ölümsüz hale gelmiştir. Hikâye, maske takmış bir adamın izleyicilere bir oyun teklif etmesiyle sona erer; oyunu kazanan kişi sonsuza erişirken diğerleri ölecektir. Layton ve Luke, sonsuz yaşamın sırrını ortaya çıkarmak için bu oyunu katılmak zorundadırlar. Olaylar, *Professor Layton and the Last Specter* ve *Professor Layton and the Miracle Mask* oyunları arasında geçmektedir.