Layton Kyouju to Eien no Utahime

Profesor Layton i jego uczennik Luke otrzymują prośbę od śpiewaczki operowej Jenis Quatlane, by przybyli na jej występ i pomogli w rozwiązaniu zagadki. Przyjaciółka Jenis, Melina, zmarła rok wcześniej, ale ponownie się pojawiła jako siedmioletnia dziewczynka, twierdząc, że odkryła sekret wiecznego życia i posiada wiedzę, jaką tylko prawdziwa Melina mogła mieć. Zaintrygowani, Layton i Luke udają się do opery Crown Petone, podczas gdy Remi zostaje w Londynie, by badać zagadnienie znikających dziewcząt. Opera opowiada historię królowej z Królestwa Nieśmiertelnych, która zachorowała i zmarła, po czym stworzono eliksir nieśmiertelności. Ludzie Królestwa, tęskniąc za swoją królową, wypili eliksir, by stali się nieśmiertni. Opowieść kończy się, gdy zakryty maską mężczyzna wyzywa widzów do gry, oferując zwycięzcy wieczne życie, a pozostałym śmierć. Layton i Luke muszą wziąć udział w grze, by odkryć prawdę o nieśmiertelności. Wydarzenia te mają miejsce między grami *Professor Layton and the Last Specter* a *Professor Layton and the Miracle Mask*.